Спектрофотометрия в лабораторной практике

Спектрофотометрия - это аналитическая техника, используемая в широком спектре отраслей промышленности, обеспечивающая количественное измерение взаимодействия исследуемого материала с электромагнитным излучением. Наиболее часто используемые спектрофотометры работают в диапазоне ультрафиолетовый и видимый свет (далее УФ/Вид, англ.: UV/Vis).

Поглощение раствора ДНК в зависимости от длины волны

Проблемы спектрофотометрического измерения различаются в зависимости от объема и концентрации образцов. В молекулярной биологии спектрофотометры УФ/Вид используются для исследования растворов образцов, таких как нуклеиновые кислоты, белки и клетки из биологических образцов. Эти образцы часто имеют ограниченный объем или высокую концентрацию, что приводит к довольно сложно решаемым проблемам. В последнее время мы наблюдается рост числа приборов позволяющих измерять поглощение в микрообъемах, не превышающих нескольких микролитров.

Большинство проблем, связанных с применением спектрофотометрии в видимой и ультрафиолетовой области спектра, являются результатом выбора пользователем неправильной методики или кюветы для образца. Вторая проблема - использование неправильной стратегии очистки. По возможности пользователи должны приобретать спектрофотометр, который оптимизирован для использования в современной научно-исследовательской лаборатории, поэтому, обратите внимание на основные моменты выбора спектрофотометра, указанные ниже.

Низкий объем или низкая концентрация

Для определения наилучшего метода спектрофотометрического измерения исследователь должен определить характеристики образца. Пользователи часто путают низкий объем с низкой концентрацией, что приводит к сомнительным данным. Понимание и применение закона Бугера-Ламберта-Бера полезно при проведении спектрофотометрического анализа и особенно важно при работе с биомолекулами, многие из которых поглощают свет. Концентрация вещества прямо пропорциональна количеству света, поглощаемого самим образцом, и обратно пропорционально логарифму прошедшего света. Поглощение образца изменяется линейно с концентрацией.

Чистота образцов

Чистота образцов важна не только в спектрофотометрическом измерении, но также в количественной оценке и других последующих экспериментах. Загрязняющие вещества в образце могут включать белки, буферные компоненты или даже клетки, в зависимости от матрицы и интересующего аналита. Стратегия подготовки проб, независимо от того, использует ли она спиновые колонки или автоматизированные комплекты с вакуумными коллекторами, должна быть оптимизирована для вашего количества и концентрации проб. Поставщики комплектов для подготовки образцов предоставляют рекомендации и руководства по выбору наилучших реактивов и процедуры для конкретного образца в дополнение к советам по предотвращению перегрузки хроматографической колонки.

Выбор кюветы

Спектрофотометр Thermo Fisher Scientific NanoDrop

Кюветы для спектрофотометра представляют собой оптически прозрачные ячейки, которые содержат раствор образца и используются для введения образцов в световод. Существует два типа кювет УФ-прозрачные и УФ-непрозрачные. Некоторые кюветы могут использоваться только в видимом диапазоне. Обязательно оцените состояние кюветы. Если она поцарапана или загрязнена, если на ней видны отпечатки пальцев или остатки конденсата, это может внести серьезные изменения в результаты эксперимента. В дополнение к разнообразию стандартных кювет, в некоторых приборах используются специальные микролитровые ячейки, используемые для количественной оценки небольших объемов. Такие кюветы особенно удобны при исследовании высококонцентрированных биомолекул, таких как белки и нуклеиновые кислоты, без разбавления образца. Также, небольшие объемы проб биологических образцов могут быть исследованы путем нанесения образца непосредственно в измерительное окно спектрофотометра, разработанного специально для анализа микрообъемов.

Требования к программному обеспечению

Очень немногие исследователи имеют возможность тратить большое количество времени на обучение работе с новым прибором. Сегодня разработка методики и процесс управления данными могут быть очень сложными. Многие из современных инструментов поставляются с программным обеспечением, которое было разработано с учетом пожеланий пользователей и имеют максимально удобный и понятный интерфейс. Важным аспектом рассмотрения также являются управление данными и их хранение. В лабораторной практике довольно часто можно встретить кратковременное отключение электропитания. Технологии, разработанные в течение последнего десятилетия, позволяют прямое и простое подключение к ПК, устраняя необходимость в дополнительном программном обеспечении или устройствах хранения.